Na mieste, kde sa dnes nachádza gréckokatolícky Katedrálny chrám sv. Jána Krstiteľa v Prešove, už koncom 14. storočia stála špitálska kaplnka postavená v neogotickom štýle. Spravovali ju augustiniáni, ktorí sa venovali starostlivosti o chorých a chudobných v nemocnici, ktorá stála hneď vedľa kaplnky. Bolo to vtedy pri Dolnej (južnej) bráne, ktorou sa vstupovalo do mesta. Nemocnica (špitál), ako aj chrám boli zasvätené Preblahoslavenej Panne Márii. Po roku 1540, počas reformácie, používali objekt chrámu slovenskí evanjelici a v niektorých obdobiach rímskokatolíci.

Na základe kráľovského rozhodnutia sa od roku 1673 stáva chrám a nemocnica majetkom minoritov, ktorí prišli z Poľska. Minoriti zmenili účel nemocnice na kláštor – konvent koncom 17. storočia, keď sa po krátkej neprítomnosti opätovne vrátili v roku 1686. Kláštor zasvätili sv. Jánovi Krstiteľovi. V rokoch 1753 – 1754 začali realizovať neskorobarokovú prestavbu s rokokovými prvkami svojho, pôvodne špitálskeho chrámu. Bola predĺžená loď chrámu, ako aj jeho orientácia smerom na západ z pôvodného východného smerovania. Pôvodná svätyňa sa zmenila na vstupnú časť predsiene s novým stropom a nad chórom, ktorý bol pribudovaný, bola zachovaná pôvodná sieťová neogotická klenba svätovítskeho typu, s desiatimi erbmi miest východného Slovenska a erbom mesta Prešov z roku 1453. Zo západnej strany bol chrám zväčšený, predĺžený a ukončený polkruhovou apsidou, kde sa nachádza dnešná svätyňa. Zo severnej strany bola pristavená veža so zvonicou. Na priečelí chrámu bol vytvorený polkruhový vstupný portál so stĺpmi. Vyššie na priečelí je situovaný oválny obraz krstu Ježiša v Jordáne.

Pápež Pius VII. bulou Relata semper kánonicky zriadil Prešovskú eparchiu dňa 22. septembra 1818. Katedrálnym chrámom sa stal Chrám sv. Jána Evanjelistu v Prešove, ktorý predtým používali minoriti. Podľa zasvätenia ich kláštora dostáva svojho patróna vo sv. Jánovi Krstiteľovi. Chrám bol prispôsobený pre slávenie bohoslužieb a obradov podľa východnej byzantskej tradície. Slávnostná posviacka katedrály sa uskutočnila 6. januára 1882.

Po násilnej likvidácii Gréckokatolíckej cirkvi 28. apríla 1950 sa katedrála dostala do vlastníctva Pravoslávnej cirkvi a späť bola vrátená až 5. júla 1968, aj to len formálne. Majetkovo-právne aj naďalej zostala jej vlastníkom Pravoslávna cirkev, i keď liturgicky tento objekt užívala Gréckokatolícka cirkev. Definitívne vyriešenie vlastníctva katedrály ukončilo rozhodnutie Ministerstva kultúry z 1. júna 1999, ktorým sa katedrála a ďalšie objekty previedli na Gréckokatolícku cirkev. V katedrále sa nachádzajú tri kaplnky, z toho dve, do ktorých sa vstupuje z lode katedrály a jedna, zasvätená Presvätej Bohorodičke – Čiernej Madone – do ktorej sa vstupuje z predsiene katedrály. Pod katedrálou sa nachádza krypta.

Pápež sv. Ján Pavol II. navštívil katedrálu 2. júla 1995. V ďalších rokoch boli zhotovené sarkofágy pre blahoslavených hieromučeníkov Pavla Petra Gojdiča OSBM (2001) a Vasiľa Hopka (2003), umiestnené pod oltármi v bočných kaplnkách. Nachádzajú sa v nich ich relikvie. V roku 2003 bola v katedrále umiestnená verná kópia Turínskeho plátna. V Katedrále sv. Jána Krstiteľa v Prešove sa nachádza aj relikvia Svätého Kristovho kríža, sv. Jána Krstiteľa, sv. prvomučeníka Štefana a viacerých ďalších svätých. Od roku 2008, kedy bola Prešovská eparchia povýšená na archieparchiu a Prešov na sídlo Gréckokatolíckej metropolitnej cirkvi sui iuris je Katedrálny chrám sv. Jána Krstiteľa katedrálou Prešovskej archieparchie.